Cучасний погляд на роль натуральних кілерних клітин у репродукції

Т. В. Радиш,
наук. співроб. ДУ «Інститут педіатрії, акушерства і гінекології ім. акад. О. М. Лук’янової АМН України»

Огляд літератури. Периферичні натуральні кілери (pNK) є важливою складовою вродженого імунітету, маткові (uNK)  – забезпечують васкуляризацію і реконструкцію спіральних артерій під час імплантації, плацентації і кровозабезпечення плода. Метою регулювання uNK через взаємодію імуноглобуліноподібних рецепторів (KIR) з HLA-G і HLA-C є інвазія трофобласта і алогенна селекція ембріонів. Лабораторні тести для оцінювання pNK патогенетично не обґрунтовані. Доцільність таких тестів, а також користь і шкода імунотерапії залишаються під питанням.

Ключові слова: натуральні кілери, імуноглобуліноподібні рецептори, головний комплекс гістосумісності, звичне невиношування, повторні невдачі імплантації, ЕКО, децидуальна оболонка, трофобласт, спіральні артерії.

Ще в середині минулого століття із загальної імунології виокремилася галузь – імунологія репродукції. Це здавалося цілком природним процесом, адже репродукцію людини, власне вагітність, вважали унікальним імунологічним феноменом, за якого генетично напівсумісний плід розвивався без перешкод в імунокомпетентному організмі матері. Пізніше стало відомо, що жодної імунологічної унікальності репродукція не має: імунні реакції, що забезпечують запліднення, імплантацію та розвиток плода, ті самі, що й за інших фізіологічних і патологічних процесів.

Протягом понад півстоліття неодноразово виникали різні теорії імунологічного забезпечення репродукції. Частина з них була спростована, інші «завмерли в часі», не отримавши подальшого розвитку, про деякі просто забули. Слід зазначити, що жодна з наукових гіпотез імунології репродукції не пройшла суворої перевірки методами доказової медицини. Що ж до клінічних надбань, то застосування різних, нестандартизованих методів лікування й лабораторного дослідження зумовили певний скептицизм серед фахівців-репродуктологів: значна частина взагалі ігнорує наявність імунних чинників репродуктивних розладів і не визнає необхідності їхнього лікування.

Мабуть, єдиним об’єктом, який викликав незмінну зацікавленість імунологів-репродуктологів від початку й до сьогодні та ще й знайшов суто практичне застосування, є натуральні кілери. Вивчення ролі цих клітин у забезпеченні розмноження нагадує біг по спіралі, коли очікувані результати часто не виправдовують сподівань, але підіймають на новий рівень знань. За допомогою аналізу результатів досліджень останнього десятиріччя спробуємо зрозуміти, яке значення мають натуральні кілери для процесу репродукції та чи є якісь практичні висновки, варті уваги клінічних фахівців.

Натуральні кілери як важливий компонент вродженого імунітету

Багато років натуральні кілери (natural killers, NK) визначали як великі гранулярні лімфоцити, які здатні вбивати клітини-мішені спонтанно, без жодної підготовки, а  взаємодія кілер-мішеней не обмежена експресією молекул головного комплексу гістосумісності (major histocompatibility complex, МНС) [1]. Зараз відомо, що насправді NK мають безліч інгібіторних й активаційних рецепторів, які взаємодіють із молекулами МНС класу I та іншими, не пов’язаними з МНС молекулами. З моменту відкриття NK клітин минуло понад 40 років, тому наші знання про їхню функцію зросли експоненційно. Раніше такі клітини вважали еволюційними попередниками більш досконалих антигеноспецифічних адаптивних ланцюгів імунної відповіді [2], проте зараз зрозуміло, що це надзвичайно складний компонент вродженого імунітету, який з’явився на еволюційній сцені вже після утворення адаптивного імунітету [3].

Традиційно поверхневий фенотип NK визначається як CD3-CD56+ [4; 5]. Подібно до Т-клітин загальна популяція CD3-CD56+ NK клітин є гетерогенною як за фенотипом, так і за функцією. Приблизно 10 % NK периферичної крові (peripheral NK, pNK) та майже 100 % NK у вторинних лімфоїдних тканинах мають високу поверхневу щільність експресії CD56, що позначається як CD56bright. Такі клітини можуть продукувати у великій кількості цитокіни й хемокіни вже через кілька хвилин після активації, але вони мають слабку здатність до цитотоксичності. А більшість pNK із низькою експресією CD56, тобто CD56dim, навпаки, мають менш виражену спроможність до продукції цитокінів і хемокінів у відповідь на активацію, проте значна їх частина здатна до спонтанного лізису клітин-мішеней [6].

NK клітини вважають відносно недовговічними. Очевидно, що вони утворюються з CD34+ гемопоетичних клітин-попередників [7–9], та щодо місця їхнього дозрівання тривалий час припущень не було. Зараз зрозуміло, що шлях дозрівання NK дуже подібний до Т-лімфоцитів, а унікальним місцем для онтогенезу NK у людини є вторинні лімфоїдні тканини, де попередники NK розвиваються у щільному контакті з дендритними клітинами [10].

Натуральні кілери зазвичай розглядають як складову вродженого імунітету, і в цьому сенсі основне завдання NK – здійснення противірусного й протиракового захисту організму шляхом знищення клітин, які не мають на своїй поверхні молекул МНС класу І й, відповідно, недоступні для цитолітичних Т-лімфоцитів. Реалізація цього завдання можлива тому, що онкотрансформовані й уражені вірусом клітини втрачають антигени гістосумісності й стають мішенями для натуральних кілерів. Проте в NK є інша важлива функція – забезпечення репродуктивного процесу, та для її розуміння варто розглянути рецептори NK.

Регуляція натуральних кілерів через імуноглобуліноподібні рецептори

Рецепторний набір натуральних кілерів багатий і різноманітний, та ми зосередимося на одній групі рецепторів – кілерних імуноглобуліноподібних рецепторах (kіller-cell immunoglobulin-like receptor, КIR). KIR є трансмембранними глікопротеїнами типу I, які належать до суперродини імуноглобулінів. Переважно їх експресують NK клітини, а також CD4, CD8 і γδ-лімфоцити [11; 12]. Ці рецептори містять як інгібіторні, так й активаційні форми і є архетипічною парною рецепторною системою [13]. Лігандами KIR, як зазначалося вище, є молекули МНС класу I. Активність NK клітин визначається балансом отриманих різних сигналів і рівновагою між інгібіторними й активаторними рецепторами. NK «сканують» поверхні навколишніх клітин, виявляють на них молекули МНС класу I й у такий спосіб розрізняють здорові й інфіковані або трансформовані клітини. Якщо спростити: взаємодія інгібіторного KIR із відповідним МНС I лігандом «забороняє» кілеру вбивати здорові клітини власного організму, відсутність такої взаємодії дає змогу вбивати хворі клітини; водночас взаємодія активаційного KIR із відповідним МНС I лігандом стимулює кілер до синтезу цитокінів або до цитотоксичності. Насправді ж, така регуляція є дуже складною і залежить щонайменше від трьох моментів: репертуару KIR на натуральних кілерах; репертуару молекул МНС класу І на клітинах/імовірних мішенях; комбінацій, які утворили рецептори та ліганди [14].

На відміну від репертуару Т- і В-клітинних рецепторів, немає жодних доказів негативного відбору чи делеції NK клітин, які експресують шкідливі або некорисні комбінації KIR [15; 16]. Водночас показано, що формування рецепторного репертуару NK дорослої людини є випадковим, генетично визначеним і не проходить відбору [17]. Проте інші дослідження показують зсув репертуару KIR у дорослих у бік рецепторів, здатних розпізнавати авто-HLA-клас I [18; 19]. При цьому в новонароджених такого не спостерігалося. Тобто формування KIR репертуару дійсно було стохастичним, але частково відбувалося під впливом інфекцій, перенесених протягом життя. Цікаво, що адаптивні (специфічні) NK клітини не утворюються за жодної з досліджених вірусних інфекцій, окрім цитомегаловірусної, ймовірно через опортуністичну вірусну реактивацію або «спеціальну» стратегію вірусу для уникнення контролю з боку NK [20–23].

KIR кодуються однією з найполіморфніших родин геному людини. Специфічні генотипи KIR, їхні гени або алелі пов’язані з відповіддю NK на різноманітні інфекційні агенти [24; 25]. З іншого боку, генотип KIR у матерів пов’язаний із перебігом вагітності й впливає на розвиток її важких ускладнень [26; 27]. Гени KIR людини мають два гаплотипи – KIR A та KIR B. Гаплотип KIR A має здебільшого фіксований склад генів, переважно гени, що кодують інгібіторні KIR. Гаплотип KIR B має більш варіабельний склад генів і містить кілька таких, що кодують активацію KIR. Є гіпотеза, за якою гаплотипи KIR A, так би мовити, спеціалізуються на боротьбі з інфекцією, водночас гаплотип KIR B забезпечує успішну репродукцію [28; 29]. Це узгоджується з тим, що гомозиготні KIR A особи демонструють кращий кліренс інфекції гепатиту C [30], а в гомозиготних KIR B матерів не розвивається прееклампсія [26; 31].

Конкретні приклади компромісів між спроможністю вижити у боротьбі з інфекцією у довгостроковій перспективі або максимізувати репродуктивний успіх у короткий відрізок часу є поодинокими. Проте дедалі більша кількість досліджень показує, що в людини гени KIR можуть бути ключовими для репродуктивної імунологічної компенсації [27; 29; 32]. Недавні обчислювальні дослідження продемонстрували, що вірусна експресія молекул МНС класу I сприяє алельній різноманітності KIR, а комбінація як активуючих, так і інгібіторних рецепторів повинна забезпечувати максимальний рівень захисту від таких вірусів. Отже, існує велика ймовірність того, що формування репертуару KIR та взаємодій KIR/МНС, в першу чергу, зумовлена патогенними мікроорганізмами. Водночас специфічна для людини локалізації KIR на гаплотипах А і В демонструє можливість формування різномаїття KIR, як внаслідое інфекційних захворювань, так і залежно від репродуктивних процесів [33].
Сучасні популяційні генетичні моделі, що базуються на результатах вивчення KIR гаплотипів, демонструють наявність щонайменше двох популяцій людей. Одна з них складається з індивідуумів, в яких NK експресують переважно інгібіторні рецептори, вони є найактивнішими й найефективнішими щодо противірусного захисту, проте не «прихильні» до репродуктивного процесу. Інша поєднує жінок, KIR репертуар яких здатен забезпечити успіх вагітності, але не в боротьбі з вірусами.

Роль натуральних кілерів у забезпеченні імплантації та розвитку плода

З огляду на наукові дані, для успішної імплантації та подальшого розвитку плода необхідне розпізнавання вагітності імунною системою матері. Умовно кажучи, запліднена яйцеклітина «просить» дозволу на імплантацію, а організм матері приймає чи відхиляє цей запит. Антигени MHC людини, які зазвичай позначають як HLA (Human Leukocyte Antigens), відіграють у цьому процесі важливу роль. Вважають, що переважно, коли HLA антигени батька подібні до материнських, імплантація не відбувається або вагітність переривається в ранні терміни. За даними низки досліджень, високий ступінь спорідненості партнерів (три або більше спільних антигенів) за HLA-A, B, DR і DQ має чітку асоціацію зі звичним викиднем. Помічено, що в пар, сумісних за двома алелями HLA-DQA1, звичний викидень спостерігається значно частіше, а кількість живих дітей суттєво нижча, ніж у фертильному контролі [34]. Зв’язок між HLA антигенами та звичним викиднем вивчений доволі детально, проте відносно небагато досліджень присвячено цьому питанню за невдач імплантації після екстракорпорального запліднення (ЕКЗ).
Вважалося, що HLA антигени визначають ступінь імунної відповіді на специфічні антигени. У пар із високою спорідненістю за HLA та періодичними втратами вагітності виявляли відсутність протипухлинних цитотоксичних антитіл, антиідіотипічних антитіл та антимікробних антитіл, які блокують реакцію лімфоцитів. Припускалося, що посилена продукція прозапальних цитокінів Т-хелперними лімфоцитами першого типу (Th-1), а також підвищена цитотоксичність природних кілерів є основними алоімунними чинниками звичного викидня [35]. Таку гіперактивність Th-1 і NK пов’язували з певними антигенами HLA або продуктами споріднених генів, як-от білки системи комплементу або фактор некрозу пухлин альфа.

Однак відомо, що клітини трофобласта спонтанно не експресують жодних класичних антигенів гістосумісності ІІ класу та HLA-A й HLA-B І класу. Водночас клітини екстраворсистого трофобласта, який вростає у децидуальну оболонку, спіральні артерії й міометрій, експресують некласичні молекули гістосумісності HLA-С батьківського походження та HLA-G і HLA-E ще до імплантації [36]. Певний час існувала теорія, що ці антигени здійснюють захист трофобласта від материнської цитотоксичності, а головну роль у такому захисті надавали HLA-G. Вважали (і такі погляди можна й досі зустріти в літературі), що HLA-G відіграє ключову роль в імплантації через модуляцію секреції цитокінів для підтриманння місцевого імуносупресивного стану, тобто HLA-G функціонує як імунодепресивний чинник і виступає механізмом захисту плаценти/ембріона від материнських NK. На користь припущення про унікальну роль HLA-G свідчать результати дослідження його розчинної форми (soluble HLA-G, sHLA-G). Так, жінки з низьким рівнем sHLA-G перед овуляцією мають високий ризик раннього викидня після ЕКЗ. Наявність високого рівня sHLA-G розглядають як позитивний прогностичний критерій у 70 % жінок віком до 39 років і в понад 50 % жінок у віці 39–44 років [37; 38].

NK клітини є популяцією лімфоцитів, яка домінує в децидуальній оболонці під час здорової вагітності. Децидуальні NK мають фенотип CD56brightCD16neg і цим відрізняються від периферичних кілерів, серед яких переважають CD56dimCD16pos [39]. Ці маткові кілери (uterine natural killers, uNK) існують у невагітному ендометрії в невеликій кількості, проте ця кількість зростає на ранніх термінах вагітності й сягає піку на 8–13 тижнях вагітності [40]. У дослідженнях останніх років показана роль розчинних факторів, що секретують uNK, під час розвитку плаценти, а саме: ремоделювання спіральних артерій і регуляції трофобластної інвазії [40; 41].

Децидуальні NK за нормальної вагітності мають низьку цитотоксичність, хоча вони містять літичні гранули й здатні до лізису класичних NK мішеней, зокрема K562 [42], а також мають потенціал для ефективного контролю і знешкодження патогенів [43; 44]. Водночас існують регуляторні механізми, які запобігають знищенню на рівні мати/плід під час здорової вагітності. До них належать інгібіторні KIR, а саме CD94/NKG2 та ILT, які розпізнають молекули І класу MHC на екстраворсистих клітинах трофобласта й блокують цитотоксичні реакції [39].

На межі мати/плід ворсисті трофобластні клітини, що контактують із материнською кров’ю, не експресують молекули МНС, їх вважають імунологічно інертними. Як вже згадувалося, клітини екстраворсистого трофобласта експресують HLA-C, HLA-E й HLA-G, але не класичні поліморфні молекули МНС (HLA-A і HLA-B). Усі алотипи HLA-C є лігандами для KIR маткових NK, HLA-E також виступає як ліганд для рецепторів більше ніж 90 % uNK, водночас HLA-G зв’язується з рецепторами на поверхні децидуальних макрофагів і меншості uNK. Рецептори NK розпізнають молекули МНС: HLA-C розпізнається інгібіторним доменом KIR рецепторів 2D, HLA-E – інгібіторним CD94/NKG2A й активуючим CD94/NKG2C, HLA-G – інгібіторним ILT2 й активуючим KIR2DL4. Усі клітини трофобласта експресують HLA-E, а усі uNK мають CD94/NKG2A, цією взаємодією забезпечується відсутність кілінгу трофобласта NK клітинами. До того ж пригнічення цитотоксичності NK також забезпечує зв’язок інгібіторного KIR з HLA-C та ILT2 з HLA-G [45].

Було припущено, що внаслідок взаємодії між KIR у матері, які присутні на uNK, та їхніми лігандами, які представлені на екстраворсистому трофобласті, регулюється плацентація. Алоімунна взаємодія KIR на материнських маткових NK клітинах із батьківським HLA-C на трофобласті може визначати успіх чи невдачу імплантації. Певні комбінації материнських KIR і батьківського HLA-C можуть бути несприятливими для вагітності, наприклад за відсутності активуючих KIR на uNK матері та наявності HLA-C2 у плoда [26; 46–48]. Дослідження генетичних асоціацій показали, що взаємодія між материнським KIR і фетальним HLA-C під час вагітності може впливати на кровозабезпечення плода. Комбінації ембріонального (тобто батьківського) HLA-C і материнського KIR, які підсилювали інгібіторні взаємодії, мали зв’язок з прееклампсією, а також зі звичним викиднем. Найбільш «небезпечною» виявився материнський KIR гаплотипу АА (без активації КIR) у сполученні з HLA-C2 у плода. Отримані результати підкреслюють важливість взаємодій МНС-КIR для регуляції плацентації й демонструють, що надлишкова інгібіція завдає шкоди плацентації. Тобто успішна імплантація й виживання ембріона визначається тонким балансом активації та інгібіції натуральних кілерів, який залежить від комбінації генів KIR у матері й батька дитини.

Дослідження останніх років піддали сумніву точку зору, що саме HLA-G є ключовою молекулою, яка запобігає агресії uNK у бік материнсько-плодової інтерфази. Виявлено, що інгібіторна дія HLA-G пов’язана з Т-клітинами, але не з NK,  причому HLA-G пригнічував проліферацію T-клітин через стимуляцію децидуальних NK до проліферації і секреції розчинних факторів [49; 50]. Наявність розчинного HLA-G в культурі ембріона після ЕКЗ було асоційоване з кращими показниками вагітності, а зниження рівня HLA-G в материнському кровотоці спостерігали за звичного викидня та прееклампсії [51]. Для успішної вагітності вирішальне значення мають ремоделювання спіральних артерій та інвазія трофобласта, які супроводжуються важливими судинними змінами у відповідь на МНС-залежні сигнали. Це відображається у патологіях, пов’язаних із дефектами васкуляризації, зокрема затримка внутрішньоутробного росту та прееклампсія [52].

NK клітини, які взаємодіяли через KIR2DL4 з sHLA-G, зазнавали змін, що характерні для старіння, а саме: змінювали форму й розмір, зупинялися на стадії G0/G1 клітинного циклу, набували резистентності до апоптозу [53]. Попри те що старіючі клітини не діляться й не зазнають апоптозу, метаболічно вони дуже активні й виділяють безліч розчинних медіаторів, які в сукупності називають асоційованим зі старінням секреторним фенотипом (senescence associated secretory phenotype, SASP) [54; 55]. SASP включає прозапальні цитокіни, фактори росту й протеази. Коли клітина старіє, вона змінює взаємодію з навколишнім середовищем опосередковано через SASP. Це може бути як шкідливим, наприклад сприяти росту пухлини і розвитку вікових патологій, так і корисним як у разі репарації тканин під час загоєння ран. SASP, індукований у NK клітинах взаємодією з розчинним HLA-G, може відігравати сприятливу роль у неоваскуляризації й ремоделюванні тканин у місцях експресії HLA-G [52].

Фактично плід, експресуючи на своїй поверхні HLA-G та продукуючи його розчинну форму, використовує NK клітини для власного виживання. Судинне ремоделювання здійснюється сукупними взаємодіями між NK і клітинами ембріонального трофобласта. Реакції NK на розчинний HLA-G, який продукує екстраворсистий трофобласт на ранніх термінах вагітності, призводять до перепрограмування NK клітин у бік старіння. Та клітинне старіння є молекулярним перемикачем, який вмикає розвиток регульованої та стійкої секреторної відповіді, що сприяє ремоделюванню судин. Саме у такий спосіб здійснюється забезпечення імплантації, плацентації й подальшого розвитку плода з боку материнських NK клітин. Однак необхідно підкреслити, що це стосується саме маткових (децидуальних) uNK.

Таким чином, маткові натуральні кілери здійснюють щонайменше два суттєвих для репродукції завдання. Взаємодіючи своїми KIR рецепторами з плодовим HLA-G, вони стають «фабриками з виробництва» цитокінів та інших розчинних факторів і в такий спосіб забезпечують успішну васкуляризацію та інвазію трофобласта. Завдяки іншій взаємодії KIR з батьківськими HLA-C, які представлені на екстраворсистому трофобласті, фактично здійснюється алоімунна селекція ембріонів.

Питання діагностики й лікування патології натуральних кілерів у репродукції

Наведені результати досліджень видаються досить переконливими. Проте пошук відповіді на питання, чи можуть бути ці розвідки використані у клінічній практиці, є драматичним. Річ у тім, що різні (кількісні, якісні, функціональні) характеристики NK у контексті репродукції вивчають вже майже 30 років, і за цей час науковці й клініцисти так і не дійшли згоди, чи варто застосовувати такі лабораторні дослідження у практиці й чи потребують вони лікування. Фактично сьогодні існують два контртабори: в одному на це запитання відповідають впевнено «так», в іншому – категорично «ні».

Кількість робіт, присвячених вивченню вмісту, фенотипу та цитотоксичної активності периферичних NK у контексті репродукції, надзвичайно велика, й детально оглядати їх в цій статті не має сенсу. Достатньо зауважити, що значна частка результатів продемонструвала підвищення вмісту NK у крові, а також підсилення їхньої цитотоксичності відносно чутливих клітин-мішеней (найчастіше – клітинної лінії К562) у жінок зі звичним викиднем і повторними невдачами імплантації після ЕКЗ [56–59]. Такі відкриття стали підґрунтям для застосування визначення кількості NK у крові та цитотоксичності периферичних NK у клінічній практиці. Водночас переважна кількість мультифакторних, мультицентрових, метааналітичних досліджень, в яких предметом аналізу були результати великої кількості обстежених (від 500 до 2 тис.) не підтвердили висновки окремих робіт і, відповідно, піддали сумніву можливість і доцільність визначення кількості та цитотоксичності NK для діагностики імунного безпліддя/невиношування [60–62].

Відповідно, немає єдиної точки зору й щодо питання про необхідність імунокорекції у разі репродуктивних розладів. Історія імунотерапії розпочалася у 90-х рр., коли для лікування звичного викидня застосували імунізацію жінки лімфоцитами чоловіка або донора, так звану лімфоцитарну імунотерапію. Її дію пов’язували з нормалізацією балансу Th1/Th2 цитокінів, а також зі здатністю впливати на NK клітини [35; 58; 63]. Альтернативою лімфоцитарній імунотерапії стали препарати імуноглобуліну для внутрішньовенного застосування (intravenous immunoglobulin, IVIg). Багатьма дослідженнями підтверджена висока ефективність застосування IVIg у жінок зі звичним викиднем і повторними невдачами імплантації після ЕКЗ. Його імуномодулювальну дію найчастіше визначають як таку, що пригнічує цитотоксичність натуральних кілерів [64; 65].

Ще одним методом лікування репродуктивних невдач стало застосування інтраліпіда, його ефективність не поступається IVIg і ймовірно пов’язана з впливом на ретикуло-ендотеліальну систему і здатністю модулювати активність NK [66; 67]. Попри обнадійливі результати імунотерапії жінок із репродуктивними втратами доцільність такого лікування не є переконливою через її недостатню обґрунтованість і відсутність чітко сформульованих показань. Очевидно, що самий-но анамнез жінки, в якому є невдалі спроби ЕКЗ та/або викидні, не може бути достатнім для імунотерапії, враховуючи її складність, вартість і побічні ефекти. У більшості робіт зазначено, що імунотерапію варто застосовувати, і вона буде ефективною лише у випадках, коли діагностовані імунні розлади [56; 65; 66]. Проте саме лабораторна діагностика імунних порушень репродукції викликає найбільше питань.

На сьогодні найчастіше для діагностики можливої патології натуральних кілерів застосовують такі тести:

  • визначення вмісту та/або абсолютної кількості NK у периферичній крові;
  • вивчення поверхневого фенотипу периферичних NK;
  • визначення цитотоксичності NK;
  • імунофенотипування маткових NK.

Імунотерапія, яку найчастіше застосовують у разі виявлення відхилень у стані NK, – це інфузії імуноглобуліну для інтравенозного застосування або інтраліпіда чи його аналогів (ліпофундин, кабівен тощо).
Варто позначити питання, які є ключовими для діагностики та лікування можливих розладів NK у репродукції:

1. Питання норми. Чи можна використовувати загальноприйняті норми, чи встановити в якості нормативних показники жінок фертильного віку з доведеною фертильністю;

2. Стандартизація й уніфікація методу визначення NK цитотоксичності. Існує кілька варіантів методу й досі невідомо, який з них найбільш надійний і стабільний.

3. Можливість екстраполяції результатів, отриманих у периферичній крові, на локальний (матковий) рівень.

4. Протоколи лікувань. Немає єдиної визначеної стратегії терапії, не визначені чітко дози, кратність, частота інфузій як для IVIg, так і для інтраліпіда та його аналогів.

Суперечливість питання щодо практичного застосування лабораторного дослідження NK з метою діагностики й прогнозування результатів ЕКЗ та перебігу вагітності найкраще висвітлює дискусія, яку провідні фахівці з імунології репродукції розгорнули на сторінках шанованого наукового журналу Human Reproduction у 2015–2016 рр. Для висвітлення проблеми нижче наведені окремі положення (аргументи та контраргументи) дискусії.

Щодо імунологічних тестів

  • Зараз жінкам, що проходять ЕКЗ або звертаються стосовно проблеми звичного викидня, пропонується дедалі більше тестів і терапій, які не є достатньо науково обґрунтованими і рекомендованими відповідними контрольними організаціями. Такі тести базуються лише на підставі припущення про необхідність пригнічення маткових NK клітин для запобігання пошкодження ембріона. Імовірно, нові процедури впроваджують для того, щоб мати змогу проводити подальші дорогі випробування й довести чи спростувати їхню ефективність [68].
  • Досі існує невизначеність щодо точної патофізіологічної основи імунологічного обстеження й терапії, але це не повинно бути бар’єром для клінічного спостереження та емпіричного догляду. Навпаки, клініцисти й дослідники мають тісно співпрацювати, щоб забезпечити кращий догляд за пацієнтами [69].
  • Головна причина того, що тести периферичних і маткових NK продемонстрували дуже слабку цінність, – поганий дизайн досліджень та велика неоднорідність пацієнтів. Імуносупресія пацієнтів без вагомих причин, без належних доказових досліджень є справжньою проблемою. Зараз зростає попит на «імунні процедури», а лікарі намагаються запропонувати пацієнтам усі можливі способи досягнення успішної вагітності. Однак слід визнати, що клінічна практика не має керуватися відчаєм і розчаруванням пацієнтів (або лікарів) [70].
    Щодо імунотерапії
  • Докази того, що терапія, спрямована на активність периферичних або маткових NK, допомагає жінкам із репродуктивними проблемами, відсутні [68].
  • Тестування натуральних кілерів зараз широко застосовується, і є дослідження, які вказують на користь цих тестів у визначенні імунної терапії для жінок з повторною репродуктивною недостатністю. Це може бути кращим підходом, ніж емпірична імунна терапія без будь-яких досліджень. Потрібні додаткові й кращі дослідження, перш ніж такий підхід буде повністю схвалений [69].
  • Стосовно дискусії про «імунні процедури», варто уточнити: периферичні й маткові NK – це абсолютно різні типи імунних клітин. Клітини рNK є цитотоксичними, вони є першою лінією захисту від вірусів, пухлин та пошкоджених клітин. На відміну від них uNK набуває своїх функціональних властивостей у внутрішньоутробному стані і, здається, відіграє важливу роль у контролі вторгнення трофобласта й розвитку здорової плаценти. Використання загального позначення «натуральні кілери» для опису цих двох контрастних підмножин NK клітин як унікального маркера в жінок із безпліддям або розладами вагітності лише сприятиме плутанині в цій галузі [70].
  • «Відсутність доказу не є доказом відсутності». Суперечливі результати спостерігали в недавньому метааналізі використання IVIg за звичного викидня без імунологічного відбору пацієнтів. Автори зробили висновок про необхідність відбору пацієнтів, в яких перевага лікування була б значною. Водночас показано, що в пацієнтів, ретельно відібраних за допомогою імунологічних тестів, застосування IVIg має значний клінічний ефект і дає змогу досягти народжуваності здорових дітей у 90 %. Попередні результати є перспективними і мають бути підтверджені добре продуманим клінічним дослідженням, яке досі не проводили [71].

Щодо перспектив і біоетики

  • Фахівці з охорони здоров’я та пацієнти мають дуже ретельно оцінити практику імуномодуляції для покращення результатів вагітності. Необхідно провести дискусію про те, як рухатися до суворішого регулювання імунотерапії в нелікарняних умовах, оскільки  очевидно, що потенційні ризики та витрати на таке лікування перевищують будь-які переваги [68].
  • Подальші дослідження імунної системи в репродукції мають проводитися науковцями у співпраці з клінічними фахівцями. Слід припинити застосовувати емпіричні методи терапії, а зосередити увагу на фундаментальних дослідженнях, і тільки після того, як їхня ефективність буде доведена, втручатися у лікування – правильно й безпечно [70].
  • Прийняття рішення в медицині – досить складне завдання, особливо щодо вагітних жінок та їхніх плодів, і більшість клініцистів роблять усе можливе, спираючись на власний досвід, сучасні наукові знання та чесність. Принцип «не нашкодити» повинен переважати, а переваги та ризики мають розглядатися так само, як і в інших сферах медичної практики. Відкриті дебати й обговорення конче необхідні в цих заплутаних і складних умовах; однак суворо руйнівні позиції стосовно терапії шкодять пацієнтам [71].

Висновки

Периферичні натуральні кілери, що циркулюють в крові, є важливою складовою вродженого імунітету. Вони мають поверхневий фенотип CD3-CD56dimCD16+/-, здатні до спонтанного цитолізу клітин-мішеней, на яких відсутні молекули комплексу гістосумісності класу І, та проявляють помірну секреторну активність. Провідна функція цих клітин – знищення малігнізованих і вражених патогенами клітин. Маткові натуральні кілери розташовані в ендометрії/децидуальній оболонці, де їх кількість значно зростає протягом першого триместру вагітності. Поверхневий фенотип маткових NK відрізняється від такого периферичних і виглядає таким чином: CD3-CD56brightCD16-. На відміну від периферичних NK маткові практично не проявляють цитотоксичність, проте здатні дуже швидко продукувати великі кількості цитокинів і ростових факторів після активації. Головна функція цих клітин – забезпечення васкуляризації та реконструкції спіральних артерій у процесах імплантації, плацентації та кровозабезпечення плода.

В основі регуляції NK клітин лежать взаємодії типу рецептор – ліганд. Серед кількох типів рецепторів, які представлені на натуральних кілерах, найбільш цікавими з погляду репродукції є так звані імуноглобуліноподібні KIR рецептори. Лігандами для них є молекули МНС І класу. Залежно від того, які саме рецептори наявні на NK клітині та з якими лігандами вони взаємодіяли, відбувається активація або пригнічення клітини-кілера. Основна мета зазначеної регуляції полягає в такому: для рNK – в їхній інгібіції для запобігання автоагресії (цитолізу клітин власного організму); для uNK – в активації при контакті з плодовим HLA-G з метою приживлення ембріона та в інгібіції при взаємодії з батьківськими HLA-C з метою біовідбору життєздатного потомства.

Периферичні й маткові NK мають спільного попередника, та різні сайти навчання та дозрівання: вторинна лімфоїдна тканина – для pNK та тканини матки – для uNK, унаслідок чого ці два типи природних кілерів відрізняються одне від одного за фенотипом і функціями. Зараз немає жодних доказів, що кількість, особливості поверхневого фенотипу, цитотоксична активність чи будь-які інші характеристики периферичних NK якимось чином пов’язані або відображають такі характеристики маткових NK. Тому лабораторні тести визначення циркулюючих у крові NK, їхніх рецепторів і цитотоксичності не мають патогенетичного підґрунтя. Доцільність таких тестів для визначення імунних розладів забезпечення репродуктивного процесу, так само як користь і безпечність імунотерапії, до сьогодні не визначена і залишається предметом дискусій.

T. V. Radysh, research fellow, SU «Institute of Pediatrics, Obstetrics and Gynecology named after Academician O. M. Lukyaanova NAMS of Ukraine», Kiev

A NEW VIEW ON THE ROLE OF NATURAL KILLER CELLS IN REPRODUCTION

The review. Peripheral natural killers (pNK) are an important component of innate immunity while uterine natural killers (uNK) provide vascularization and remodelling of spiral arteries in the processes of implantation, placentation and blood supply to the fetus. The goal of uNK regulation through the interaction of immunoglobulin-like receptors (KIR) with HLA-G and HLA-C is, respectively, trophoblast invasion and allogeneic selection of embryos. Laboratory tests for assessing pNK did not based on pathogenesis, the appropriateness of such tests, as well as the benefits and harms of immunotherapy is questionable.
Key words: natural killer cells, immunoglobulin-like receptors, major complex of histocompatibility, recurent miscarriage, recurrent implantation failure, IVF, decidua, trophoblast, spiral arteries.

Т. В. Радыш, канд. биол. наук, науч. сотруд., ГУ «Институт педиатрии, акушерства и гинекологии им. акад. Е. М. Лукьяновой АМН Украины», Киев

СОВРЕМЕННЫЙ ВЗГЛЯД НА РОЛЬ НАТУРАЛЬНЫХ КИЛЛЕРНЫХ КЛЕТОК В РЕПРОДУКЦИИ

Обзор литературы. Периферические натуральные киллеры (pNK) являются важной составляющей врожденного иммунитета, маточные (uNK) обеспечивают васкуляризацию и реконструкцию спиральных артерий в ходе имплантации, плацентации и кровообеспечения плода. Целью регуляции uNK через взаимодействие иммуноглобулиноподобных рецепторов (KIR) с HLA-G и HLA-C является инвазия трофобласта и аллогенная селекция эмбрионов. Лабораторные тесты для оценки pNK патогенетически не обоснованы, целесообразность таких тестов, а также польза и вред иммунотерапии остается под вопросом.
Ключевые слова: натуральные киллеры, иммуноглобулиноподобные рецепторы, главный комплекс гистосовместимости, привычное невынашивание, повторные неудачи имплантации, ЭКО, децидуальная оболочка, трофобласт, спиральные артерии.

ЛІТЕРАТУРА/ REFERENCES

1. Herberman R. B., Nunn M.E., Holden H.T., Lavrin D.H. Natural cytotoxic reactivity of mouse lymphoid cells against syngeneic and allogeneic tumors, II: characterization of effector cells. Int. J. Cancer.  1975; 16: 230-239.

2. Janeway C.A. Natural killer cells: a primitive immune system. Nature. 1989; 341: 108.

3. Parham P. MHC class I molecules and KIRs in human history, health and survival. Nat. Rev. Immunol. 2005; 5: 201-214.

4. Lanier L. L., Testi R., Bindl J., Phillips J.H. Identity of Leu-19 (CD56) leukocyte differentiation antigen and neural cell adhesion molecule. J. Exp. Med. 1989;169: 2233-2238.

5. Ritz J., Schmidt R. E., Michon J., Hercend T., Schlossman S. F. Characterization of functional surface structures on human natural killer cells. Adv Immunol. 1988;42:181–211.

6. Walzer T., Jaeger S., Chaix J., Vivier E. Natural killer cells: from CD3(-)NKp46(+) to post-genomics meta-analyses. Curr. Opin. Immunol. 2007;19: 365-372.

7. Galy A., Travis M., Cen D., Chen B. Human T. B. Natural killer, and dendritic cells arise from a common bone marrow progenitor cell subset. Immunity. 1995;3:459-473.

8. Miller J. S., Alley K. A., McGlave P. Differentiation of natural killer (NK) cells from human primitive marrow progenitors in a stroma-based long-term culture system: identification of a CD34+7+ NK progenitor. Blood. 1994;83:2594-2601.

9. Shibuya A., Kojima H., Shibuya K., Nagayoshi K., Nagasawa T., Nakauchi H. Enrichment of interleukin-2-responsive natural killer progenitors in human bone marrow. Blood. 1993;81:1819-1826.

10. Caligiuri M.A. Human natural killer cells. Blood. 2008; 112(3):461-469.

11. Bjorkstrom N. K., Beziat V., Cichocki F., Liu L. L., Levine J., Larsson S. et al. CD8 T cells express randomly selected KIRs with distinct specificities compared with NK cells. Blood. 2012;120: 3455-3465.

12. Remtoula N., Bensussan A., Marie‐Cardine A. Cutting edge: selective expression of inhibitory or activating killer cell Ig‐like receptors in circulating CD4+ T lymphocytes. J. Immunol. 2008; 180: 2767-2771.

13. Barclay A. N., Hatherley D. The counterbalance theory for evolution and function of paired receptors. Immunity. 2008; 29: 675-678.

14. Béziat V., Hilton H.G., Norman P.J., Traherne J.A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 2017; 150(3): 248-264.

15. Bari R., Thapa R., Bao J., Li Y., Zheng J., Leung W. et al. KIR2DL2/2DL3‐E(35) alleles are functionally stronger than ‐Q(35) alleles. Sci. Rep. 2016; 6: 23689.

16. Anfossi N., Andre P., Guia S., Falk C.S., Roetynck S., Stewart C.A. et al. Human NK cell education by inhibitory receptors for MHC class I. Immunity. 2006; 25:331-342.

17. Andersson S., Fauriat C., Malmberg J. A., Ljunggren H.G., Malmberg K. J. KIR acquisition probabilities are independent of self‐HLA class I ligands and increase with cellular KIR expression. Blood. 2009; 114: 95-104.

18. Yawata M., Yawata N., Draghi M., Partheniou F., Little A.M., Parham P. MHC class I‐specific inhibitory receptors and their ligands structure diverse human NK‐cell repertoires toward a balance of missing self‐response. Blood. 2008; 112: 2369-2380.

19. Schonberg K., Sribar M., Enczmann J., Fischer J. C., Uhrberg M. Analyses of HLA‐C‐specific KIR repertoires in donors with group A and B haplotypes suggest a ligand‐instructed model of NK cell receptor acquisition. Blood. 2011; 117: 98-107.

20. Beziat V., Dalgard O., Asselah T., Halfon P., Bedossa P., Boudifa A. et al. CMV drives clonal expansion of NKG2C+ NK cells expressing self‐specific KIRs in chronic hepatitis patients. Eur. J. Immunol. 2012; 42: 447-457.

21. Brunetta E., Fogli M., Varchetta S., Bozzo L., Hudspeth K. L., Marcenaro E. et al. Chronic HIV‐1 viremia reverses NKG2A/NKG2C ratio on natural killer cells in patients with human cytomegalovirus co‐infection. AIDS. 2010; 24: 27-34.

22. Wilkinson G. W., Tomasec P., Stanton R.J., Armstrong M., Prod’homme V., Aicheler R. et al. Modulation of natural killer cells by human cytomegalovirus. J. Clin. Virol. 2008; 41: 206-212.

23. Fielding C. A., Aicheler R., Stanton R. J., Wang E. C., Han S., Seirafian S. et al. Two novel human cytomegalovirus NK cell evasion functions target MICA for lysosomal degradation. PLoS Pathog. 2014; 10: e1004058.

24. Gao X., Jiao Y., Wang L., Liu X., Sun W., Cui B., et al. Inhibitory KIR and specific HLA-C gene combinations confer susceptibility to or protection against chronic hepatitis B. Clin Immunol. 2010; 137:139-146.

25. Hirayasu K., Ohashi J., Kashiwase K., Hananantachai H., Naka I., Ogawa A. et al. Significant association of KIR2DL3-HLA-C1 combination with cerebral malaria and implications for co-evolution of KIR and HLA. PLoS Pathog. 2012; Vol. 8(3).

26. Hiby S. E., Apps R., Sharkey A. M., Farrell L. E., Gardner L., Mulder A., et al. Maternal activating KIRs protect against human reproductive failure mediated by fetal HLA-C2 . J. Clin. Invest. 2010; 120: 4102-4110.

27. Hiby S. E., Apps R., Chazara O., Farrell L. E., Magnus P., Trogstad L., et al. Maternal KIR in combination with paternal HLA-C2 regulate human birth weight. J. Immunol.  2014; 192: 5069-5073.

28. Parham P. The genetic and evolutionary balances in human NK cell receptor diversity // Semin. Immunol. 2008; 20: 311-316.

29. Parham P., Moffett A. Variable NK cell receptors and their MHC class I ligands in immunity, reproduction and human evolution. Nat. Rev. Immunol. 2013; 13:133-144.

30. Khakoo S. I., Thio C. L., Martin M. P., Brooks C. R., Gao X., Astemborski J. et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 2004; 305: 872-874.

31. Nakimuli A., Chazara O., Hiby S.E., Farrell L., Tukwasibwe S., Jayaraman J. et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2015;112:845-850.

32. Khakoo S. I., Jamil K. M. KIR/HLA interactions and pathogen immunity. J Biomed Biotechnol. 2011

33. Penman B. S., Moffett A., Chazara O., Gupta S., Parham P. Reproduction, infection and killer-cell immunoglobulin-like receptor haplotype evolution. Immunogenetics. 2016; 68(10):755-764.

34. Ober C., Aldrich C. L., Chervoneva I., Billstrand C., Rahimov F., Gray Y. L., Hyslop T. Variation in the HLA-G promoter region influences miscarriage rates. Am. J. Hum. Genet. 2003; 72(6):1425-1435.
35. Pandey M. K., Thakur S., Agrawal S. Lymphocyte immunotherapy and its probable mechanism in the maintenance of pregnancy in women with recurrent spontaneous abortion. Arch. Gynecol. Obstet. 2004; 269(3):161-172.
36. Onno M., Guillaudeux T, Amiot L, Renard I, Drenou B, Hirel B, Girr M, Semana G, Le Bouteiller P, Fauchet R. The HLA-G gene is expressed at a low mRNA level in different human cells and tissues. Hum. Immunol. 1994; 41(1):79-86.
37. Roussev R. G., Coulam C. B. HLA-G and its role in implantation. J. Assist. Reprod. Genet. 2007; 24: 288-295.
38. Rebmann V., Switala M., Eue I., Grosse-Wilde H. Soluble HLA-G is an independent factor for the prediction of pregnancy outcome after ART: a German multi-centre study. Hum. Reprod. 2010; 25 (7):1691-1698.
39. Moffett-King A. Natural killer cells and pregnancy. Nat. Rev. Immunol. 2002; 2: 656-663.

40. Bulmer J. N., Lash G. E. Human uterine natural killer cells: a reappraisal.   Mol. Immunol. 2005; 42: 511-521.

41. Hanna J., Goldman-Wohl D., Hamani Y., Avraham I., Greenfield C., Natanson-Yaron S. et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal–maternal interface. Nat. Med. 2006; 12: 1065-1074.

42. Kopcow H. D., Allan D. S., Chen X., Rybalov B., Andzelm M. M., Ge B. et al. Human decidual NK cells form immature activating synapses and are not cytotoxic. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 15563-15568.

43. Le Bouteiller P. Human decidual NK cells: unique and tightly regulated effector functions in healthy and pathogen-infected pregnancies. Front. Immunol. 2013; 4: 404.

44. Siewiera J., El Costa H., Tabiasco J., Berrebi A., Cartron G., Le Bouteiller P. et al. Human cytomegalovirus infection elicits new decidual natural killer cell effector functions. PLoS Pathog. 2013; 9:e1003257.

45. Trowsdale J., Moffett A. NK receptor interactions with MHC class I molecules in pregnancy. Semin Immunol. 2008;  20; 317-320.

46. Hiby S. E., Walker J. J., O’Shaughnessy K. M., Redman C. W., Carrington M. et al. Combinations of maternal KIR and fetal HLA-C genes influence the risk of preeclampsia and reproductive success. J. Exp. Med. 2004; 200: 957-965.
47. Hiby S. E., Regan L., Lo W., Farrell L., Carrington M. et al. Association of maternal killer-cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA-C genotypes with recurrent miscarriage.  Hum. Reprod. 2008; 23: 972-976.
48. Faridi R. M., Das V., Tripthi G., Talwar S., Parveen F. et al. Influence of activating and inhibitory killer immunoglobulin-like receptors on predisposition to recurrent miscarriages. Hum. Reprod. 2009; 24: 1758-1764.

49. Van der Meer A., Lukassen H.G., van Cranenbroek B., Weiss E.H., Braat D.D., van Lierop M.J., et al. Soluble HLA-G promotes Th1-type cytokine production by cytokine-activated uterine and peripheral natural killer cells. Mol. Hum. Reprod. 2007; 13:123-133.

50. Li C., Houser B.L., Nicotra M.L., Strominger J.L. HLA-G homodimer-induced cytokine secretion through HLA-G receptors on human decidual macrophages and natural killer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106: 5767-5772.

51. Rizzo R., Vercammen M., van de Velde H., Horn P.A., Rebmann V. The importance of HLA-G expression in embryos, trophoblast cells, and embryonic stem cells. Cell. Mol. Life Sci. 2010; 68: 341-352.

52. Rajagopalan S. HLA-G-mediated NK cell senescence promotes vascular remodeling: implications for reproduction. Cell. Mol. Immunol. 2014; 11(5): 460-466.

53. Rajagopalan S., Long E. O. Cellular senescence induced by CD158d reprograms natural killer cells to promote vascular remodeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109: 20596-20601.

54. Kuilman T., Peeper D. S. Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nat. Rev. Cancer. 2009; 9: 81-94.

55. Coppe J. P., Desprez P. Y., Krtolica A., Campisi J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu. Rev. Pathol. 2010;5:99-118.

56. Ramos-Medina R., Garcia-Segovia A., Leon J. A., Alonso B., Tejera-Alhambra M. et al. New decision-tree model for defining the risk of reproductive failure. Am. J. Reprod. Immunol. 2013; 70: 59-68.

57. Mardanian F., Kazeroonizadeh M., Rashidi B. Evaluation of CD56(dim) and CD56(bright) natural killer cells in peripheral blood of women with IVF failures. Iran. J. Reprod. Med. 2016; 13: 577-582.

58. Liang P., Mo M., Li G. G., Yin B., Cai J. et al. Comprehensive analysis of peripheral blood lymphocytes in 76 women with recurrent miscarriage before and after lymphocyte immunotherapy. Am. J. Reprod. Immunol. 2012; 68:164-174.

59. Yuan J., Li J., Huang S.Y., Sun X. Characterization of the subsets of human NKT-like cells and the expression of Th1/Th2 cytokines in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion. J. Reprod. Immunol. 2015; 110: 81-88.

60. Seshadri S., Sunkara S. K. Natural killer cells in female infertility and recurrent miscarriage: a systematic review and meta-analysis. Hum. Reprod. Update. 2014; 20(3): 429-438.
61. Polanski L. T., Barbosa M. A., Martins W. P., Baumgarten M. N., Campbell B., Brosens J., Quenby S., Raine-Fenning N. Interventions to improve reproductive outcomes in women with elevated natural killer cells undergoing assisted reproduction techniques: a systematic review of literature. Hum. Reprod. 2014; 29(1):65-75.
62. Katano K., Suzuki S., Ozaki M., Suzumori N., Kitaori N., Peripheral natural killer cell activity as a predictor of recurrent pregnancy loss: a large cohort study. Fertil. Steril. 2013;100:1629-1634.
63. Pandey M. K., Thakur S., Agrawal S. Lymphocyte immunotherapy and its probable mechanism in the maintenance of pregnancy in women with recurrent spontaneous abortion. Arch. Gynecol. Obstet. 2004; 269(3):161-172.
64. Han A. R., Lee S. K. Immune modulation of i.v. immunoglobulin in women with reproductive failure. Reprod. Med. Biol. 2018; 17(2):115-124.
65. Clark D. A., Coulam C. B., Stricker R. B. Is intravenous immunoglobulins (IVIG) efficacious in early pregnancy failure? A critical review and meta-analysis for patients who fail in vitro fertilization and embryo transfer (IVF). J. Assist. Reprod. Genet. 2006; 23(1):1-13.

66. Coulam C. B., Acacio B. Does immunotherapy for treatment of reproductive failure enhance live births? Am. J. Reprod. Immunol. 2012; 67(4): 296-304.

67. Allahbadia G.A. Intralipid Infusion is the Current Favorite of Gynecologists for Immunotherapy. J. Obstet. Gynaecol. India. 2015; 65(4):213-217.

68. Moffett A., Shreeve N. First do no harm: uterine natural killer (NK) cells in assisted reproduction. Hum. Reprod. 2015; 30(7):1519-1525.
69. Sacks G. Enough! Stop the arguments and get on with the science of natural killer cell testing. Hum. Reprod. 2015(7) : 1526-1531.
70. Alecsandru D., García-Velasco J.A. Immune testing and treatment: still an open debate. Hum. Reprod. 2015; 30(8):1994.
71. Sánchez-Ramón S., Comins-Boo A., Beltrán M.N., Segovia A.G., Herrera J.G. The absence of evidence is not the evidence of absence. Hum. Reprod. 2016; 31(1): 217-218.

START TYPING AND PRESS ENTER TO SEARCH