Забезпечення ефективності лабораторної складової церві кального скринінгу

О. В. Рыкова, руководитель клинического направления лабораторной диагностики медицинской лаборатории «Синэво»

Цитологическое исследование эпителия шейки матки сегодня по-прежнему занимает основополагающее место в цервикальном скрининге, несмотря на все современные знания о роли вируса папилломы человека (ВПЧ) и принятые сегодня в мире алгоритмы использования ВПЧ-тестирования как теста:

  • дополняющее цитологическое исследование (котестинг);
  • теста сортировки патологических результатов ПАП-теста (триаж);
  • первичного скрининга.

Предложенное еще в 40-х годах прошлого столетия Г. Папаниколау, данное исследование продемонстрировало свою эффективность в снижении заболеваемости и смертности от рака шейки матки (РШМ) более чем на 50 % при обеспечении регулярности обследования женщин и полноценном охвате целевой аудитории. Главное преимущество цитологического исследования перед ВПЧ-тестированием – возможность оценить наличие и характер изменений в клетках эпителия шейки матки.

Какое цитологическое исследование наиболее эффективно в выявлении патологии: традиционный ПАП-тест или жидкостная цитология?

Диагностическая чувствительность традиционного цитологического исследования (материал наносится на стекло после взятия материала) в среднем составляет около 60 %, а это значит, что в 40 % результаты не соответствуют степени имеющихся изменений (являются ложноотрицательными). Это связано с целым рядом факторов:

  • высокая зависимость эффективности цитологического исследования от соблюдения правил подготовки к взятию материала, корректности взятия (использование специальных инструментов), типа зоны трансформации, правильности нанесения материала на стекло и использования или нет спиртовой фиксации;
  • ограниченная возможность получения тонкослойного препарата при наличии примеси слизи, клеточного детрита, крови;
  • процесс высушивания клеточного материала после нанесения приводит к частичной деформации клеток, что может повлиять на корректность цитологического заключения.

Все эти факторы ведут к следующим проблемам:

  • достаточно высокий процент получения некачественных мазков (по разным данным, колебания могут быть от 10 % и выше), требующих повторного взятия материала;
  • сложности в оценке цитологического препарата специалистом лаборатории: малое количество клеток или избыток клеток, наслоение клеток, механическое повреждение клеток, неправильная фиксация, присутствие клеток крови. Все это приводит к возможности либо несвоевременно выявить атипичные клетки в результате наличия обильного фона, либо некорректно оценить характер изменений в результате наслоения клеток и других факторов влияния.

Жидкостная цитология позволила устранить часть проблем традиционной цитологии, что обеспечило повышение диагностической специфичности и чувствительности данного метода вторичной профилактики РШМ  до 80 %. Основные преимущества данного метода цитологического исследования следующие:

  • сохраняется весь материал, взятый с поверхности шейки матки: известно, что при традиционной цитологии «потери» клеточного материала при переносе на стекло составляют до 38 %;
  • влажная фиксация материала в консервирующей жидкости в транспортном контейнере позволяет сохранить клетки в нативном состоянии до момента поступления в лабораторию, в том числе и при комнатной температуре, исключает появление артефактов при высушивании на воздухе, обеспечивает хорошее окрашивание клеточных структур по Папаниколау;
  • позволяет получить цитологический препарат высокого качества за счет стандартизации и автоматизации процесса его приготовления;
  • цитологические препараты жидкостной цитологии монослойные, т. е. клетки расположены в один слой, что значительно повышает процент выявления атипичных клеток на ранних стадиях и снижает процент ложноположительных результатов, которые могут возникать при традиционной цитологии за счет «наслоения» клеток и ошибочной интерпретации характера изменения клеточных структур;
  • дает возможность приготовить дополнительные препараты (до 5), если первый цитологический препарат оказался неудовлетворительным за счет недостаточного количества клеток или есть необходимость уточнить характер клеточных изменений;
  • материал жидкостной цитологии может быть использован для проведения вспомогательных исследований: ВПЧ-тестирования, определения маркеров пролиферации р16/ki-67 и других иммунноцитохимических исследований, выявления других ИППП.

Практическому врачу-гинекологу важно не только выбирать какую цитологию использовать (традиционную или жидкостную), но и какую жидкостную, т. к. существуют различные технологии. Одна из них – это технология компании Becton Dickinson (BD) SurePath™, США, которая имеет целый ряд преимуществ:

  • одобрена FDA в США с 1999 г., с 2004 г. официально одобрена NICE  в Англии и Уэльсе. Зарегистрирована в Украине;
  • повышает качество цитологического препарата за счет технологии обогащения клеточного материала (специальная технология удаления всех примесей, которые могут препятствовать получению качественного монослойного препарата);
  • полная автоматизация процесса нанесения материала на стекло и последующей окраски по Папаниколау;
  • одобрена FDA для проведения из материала жидкостной цитологии ВПЧ-тестирования, иммуноцитохимических исследований и выявления ИППП.

Для клинициста это дает целый ряд диагностических возможностей:

  • повысить эффективность цервикального скрининга – увеличить своевременную выявляемость умеренной/тяжелой дисплазии (категории HSIL по системе Бетесда) на 64,4 %;
  • избежать повторных взятий цитологий (практически отсутствуют варианты неудовлетворительных цитологических препаратов), что особенно важно у беременных, у женщин с атрофическими изменениями эпителия;
  • проводить цитологическое исследование в клинических ситуациях, когда сложно получить качественный цитологический препарат при традиционном нанесении материала на стекло – при наличии большого количества слизи, клеточного детрита, крови (в первую очередь, при воспалении);
  • использовать материал жидкостной цитологии для проведения ВПЧ-тестирования и иммунноцитохимических исследований (определения маркеров пролиферации), и использовать алгоритмы мировой доказательной медицины, основанные на котестинге.

Решаются ли все проблемы обеспечения качества цитологического исследования при переходе на жидкостную цитологию?

Нет, не решаются. Качество цитологического исследования в обеспечении эффективности вторичной профилактики РШМ (независимо от того, какой метод приготовления мазка используется) зависит от:

  • строго соблюдения правил подготовки;
  • качества взятия материала (соблюдения техники взятия материала специальными инструментами);
  • качества окраски;
  • квалификации цитолога;
  • стандартизации формирования и выдачи заключений.

В руководстве «European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening: recommendations for collecting samples for conventional and liquid-based cytology», 2007 г., указаны факторы, которые влияют на качество получения материала для цитологического исследования:

  • менструация, кровянистые выделения;
  • воспалительный процесс во влагалище, наличие инфекции;
  • менее 24 ч после полового контакта;
  • тяжелая атрофия (менопауза);
  • беременность, послеродовый период (до 6–8 недель после родоразрешения) и период лактации;
  • физические манипуляции или воздействие химических и/или медикаментозных веществ: вагинальный осмотр, применение кремов, жидкостей, любрикатов, препаратов местного действия, спринцевание (менее чем за 24 ч до взятия мазка), кольпоскопия и проведение проб с уксусной кислотой и раствором Люголя (менее чем за 24 ч), взятие материала для цитологического исследования (менее чем за 3 недели), вмешательства на шейке матки (менее чем за 3 месяца).

Все вышеперечисленные факторы влияют на качество цитологического мазка и могут привести к ошибке в оценке характера изменений эпителия и выдаче некорректного цитологического заключения. Это определяет необходимость исключения данных факторов перед взятием материала для цитологического исследования или в случаях клинической невозможности – учета их влияния на результаты цитологии. Жидкостная цитология позволяет устранить только некоторые факторы влияния – это удалить примеси крови, детрита, слизи и сохранить все взятые клетки эпителия шейки матки.

Особого внимания заслуживает ограниченная возможность получения адекватного материала в случаях наличия у женщины зоны трансформации 3 типа, когда отсутствие возможности визуализации зоны стыка в цервикальном канале значительно ухудшает возможность получения полноценного материала. Другая проблема – сроки взятия повторной цитологии. Самый минимальный срок – это взятие в следующем менструальном цикле (или не раннее чем через 3 недели). В руководствах США и Англии рекомендуется через 2–4 месяца или 3 месяца, соответственно.

Цитологическая диагностика будет эффективной при получении материала зоны трансформации и эпителия цервикального канала: именно наличие строго определенного количества клеток этих зон говорит о качестве мазка и позволяет цитологу адекватно провести оценку характера изменений и сформировать  цитологическое заключение. Для взятия материла должны применяться только специальные инструменты, гарантирующие получение клеток со всех указанных зон и обеспечивающие информативность препарата: щетка Валлаха (сervex-brush), сervex-brush combi, цитобраш (щетка эндоцервикальная). После взятия материал наносится на стекло (в случае традиционной цитологии) и высушивается на воздухе после обработки специальным спиртовым спреем, в случае жидкостной цитологии – материал помещается в жидкую консервирующую среду. В лабораторию доставляется материал: стекло или транспортный контейнер. В случае жидкостной цитологии данный материал специальным оборудованием наносится в виде монослойного препарата на стекло. После получения мазков в лаборатории проводится окрашивание – наиболее эффективным в мире признано окрашивание мазков по Папаниколау, т. к. именно данные краски позволяют хорошо прокрасить структуры клетки, в первую очередь, ядро  – и последующая оценка цитологом.

Основными мировыми руководствами по цитологическому скринингу рекомендовано выдавать цитологические заключения в соответствии с системой Бетесда. Что это за терминологическая система?

Данная система была принята в декабре 1988 г. [The 1988 Bethesda System (TBS)] группой специалистов в области цитологии, гистопатологии и клиницистов в городе Бетесда, штат Мериленд, США. Она несколько раз пересматривалась (1998, 2001 гг.) и последний пересмотр произошел в 2014 г.

Что положено в основу данной системы и как она коррелирует с принятой в Украине системой выдачи цитологических заключений по Папаниколау?

В основу системы Бетесда в отличие от Папаниколау были положены знания об этиологической роли ВПЧ в развитии рака шейки матки (РШМ) и понимание процесса канцерогенеза.

Данная система предлагает двухуровневую систему отчетности для плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (LSIL  и  HSIL), которые отражают биологию инфицирования ВПЧ:

  • продуктивную (эписомальную) стадию и соответствующую категории LSIL;
  • интегрированную, соответствующую HSIL.

Данная система выдачи коррелирует с другими системами выдачи следующим образом.

Рис. 1. Сравнение 4 цитологических классификаций: системы Бетесда, 2001, ЦИН номенклатуры, классификации по типам дисплазии, классификация по Папаниколау. Цветами выделены основные градации морфологических изменений в эпителии шейки матки и корреляция между различными классификациями: голубая – норма, зеленая – неоднозначные изменения, желтая – LSIL (связанная с инфицированием ВПЧ), оранжевая – НSIL (ВПЧ- индуцированные интраэпителиальные неоплазии), красная – карцинома.

Аббревиатуры:

CIN: cervical intraepithelial neoplasia (ЦИН, цервикальная интраэпителиальная неоплазия); ASC-US: atypical squamous cells of undetermined significance; ASC-H: atypical squamous cells, cannot exclude an HSIL; NILM: negative for intraepithelial lesion and malignancy; ASC – atypical squamous cells; SIL: squamous intraepithelial lesion; LSIL: low-grade squamous intraepithelial lesion; HSIL: high-grade squamous intraepithelial lesion; KA: koilocytotic atypia (HPV effect); HPV: human papillomavirus; CA: invasive carcinoma; NOS: not otherwise specified; Mild: mild dysplasia; Mod: moderate dysplasia; Sev: severe dysplasia; and CIS: carcinoma in situ.

Какие основные пункты цитологического заключения в соответствии с системой Бетесда, 2014 г.?

Основные категории:

  • отрицательные в отношении интраэпителиальных поражений и злокачественности (NILM, Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy);
  • другие (см. интерпретация, например, эндометриальные клетки у женщин ≥ 45 лет);
  • интраэпителиальная атипия (см. интерпретация, указание атипии в плоском или железистом эпителии).

Интерпретация/результат

Отрицательные в отношении интраэпителиальных поражений и злокачественности (NILM, Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy)

Неопухолевые изменения (с указанием типа изменений)

  • Неопухолевые клеточные изменения:
  1. Плоскоклеточная метаплазия.
  2. Кератоз.
  3. Трубная метаплазия.
  4. Атрофия.
  5. Изменения, связанные с беременностью.
  • Реактивные клеточные изменения, связанные с:
  1. Воспалением (включая репаративные изменения).

а) лимфоцитарным (фолликулярным) цервицитом.

  1. Лучевые изменения.
  2. Изменения, связанные с внутриматочной контрацепцией.
  • Наличие железистых клеток после гистерэктомии.

Специфические инфекционные агенты:

  • Trichomonas vaginalis.
  • Грибковые организмы, морфологически сходные с Candida spp.
  • Изменения флоры, соответствующие бактериальному вагинозу.
  • Бактерии, морфологически сходные с Actinomyces.
  • Клеточные изменения, связанные с вирусом Herpex simplex.
  • Клеточные изменения, связанные с Cytomegalovirus.

Другие

  • клетки эндометрия (у женщин в возрасте ≥ 45 лет) при условии, если результат цитологического исследования NILM.

Эпителиальная атипия

Атипия плоского эпителия

  • Клетки плоского эпителия с атипией:

a) неясного значения (ASC-US: Atypical squamous cells of undetermined significance (атипичные клетки плоского эпителия неясного значения);

b) не исключающие высокую степень поражения (ASC-H: Atypical squamous cells cannot exclude HSIL (атипичные клетки плоского эпителия, не позволяющие исключить высокую степень поражения);

  • Интраэпителиальные поражения низкой степени злокачественности (LSIL: Low-grade squamous intraepithelial lesion). Включает: признаки ВПЧ-инфекции, легкая дисплазия, ЦИН 1);
  • Интраэпителиальные поражения высокой степени злокачественности (HSIL: High-grade squamous intraepithelial lesion). Включает: умеренная, тяжелая дисплазия (ЦИН 2, ЦИН 3), подозрение на рак, рак  in situ, CIS.

Железистого эпителия

  • Атипичные клетки железистого эпителия (без дополнительного уточнения (БДУ) или с уточнением в комментариях):

a) эндоцервикальные клетки;

b) эндометриальные клетки;

c) железистые клетки;

  • Атипичные клетки железистого эпителия:

a) эндоцервикальные клетки /железистые клетки с подозрением на неоплазию (AGC favor neoplastic );

  • Эндоцервикальная аденокарцинома in situ (AIS).
  • Аденокарцинома:

a) эндоцервикальная;

b) эндометриальная;

c) внематочная;

d) без дополнительного уточнения (БДУ).

Другие злокачественные новообразования (указать какие).

Дополнительные тесты (результаты исследования).

Указание использования компьютеризированной интерпретации препарата (если применялась).

Замечания и рекомендации (по желанию): краткие и в соответствии с клиническими рекомендациями, опубликованными профессиональными организациями.

Кроме того, обязательно указывается:

  • тип цитологического препарата: традиционный цитологический препарат (ПАП-тест), препарат, приготовленный методом  жидкостной цитологии, другие;
  • адекватность цитологического препарата (оценка качества препарата): материал удовлетворительный для исследования (описание присутствия или отсутствия клеток эндоцервикального компонента и зоны трансформации, указание других факторов качества препарата, например, частичное закрытие элементами крови, воспаления и другое) или материал неудовлетворительный для исследования (с указанием причины).

Что дает клиницисту указание об адекватности цитологического  препарата?

Оценка адекватности образца рассматривается многими специалистами как наиболее важный компонент качества системы Бетесда. Качественный мазок является одним из ключевых факторов в обеспечении эффективности цитологического исследования, а именно: диагностической чувствительности цитологии. Согласно руководству критериями удовлетворительного для интерпретации мазка является наличие:

  • 8 000–12 000 клеток плоского эпителия для традиционной цитологии;
  • 5 000 клеток плоского эпителия для мазков жидкостной цитологии;
  • наличие не менее 10 клеток цилиндрического или метаплазированного эпителия.

Однако не всегда в мазок попадает достаточное количество клеток цилиндрического или метаплазированного эпителия при условии достаточного количества плоскоклеточного. Это может быть связано с особенностями шейки матки и возможностью  получить полноценный материал из цервикального канала. Данная ситуация возможна в случаях зоны трансформации 3 типа, выраженных воспалительных процессах, сужении цервикального канала. В таком случае, согласно требованиям системы Бетесда, мазок расценивается как удовлетворительный, но указывается, что нет или мало клеток железистого эпителия. Это определяет необходимость поиска причин сложностей получения клеток из эндоцервикального канала, по возможности устранения их (например, противовоспалительного лечения) и повторного взятия материала. Однако в случаях выраженного сужения канала, глубокого расположения зоны стыка это не всегда приводит к улучшению качества взятия материала, что требует рассмотрения других методов оценки характера патологических изменений. Критериями неудовлетворительного качества мазка является перекрытие его элементами воспаления или эритроцитами более чем на 75 % (что практически исключено при использовании жидкостной цитологии), недостаточное количество клеток плоского эпителия.

Какие изменения относятся к категории «Негативные в отношении интраэпителиальных поражений и злокачественности мазка, NILM»?

Система Бетесда 2014 г. была расширена за счет описания клеточных изменений, которые  не связаны с наличием неопластических процессов. К данной категории относятся все мазки, в которых не выявлены клеточные признаки неоплазии. Очень важным является понимание, что в данную категорию включаются не только мазки, в которых не выявлено каких-либо изменений, но и мазки, в которых могут быть выявлены те или иные микроорганизмы, воспалительные или репаративные изменения, которые отражают доброкачественные изменения, связанные с целым рядом причин. Это, в первую очередь, гормональные сдвиги, колебания рН, воспаление. Кроме того, возможны изменения, обусловленные влиянием внешних факторов (воздействие радиации, инородных материалов).

Неопухолевые варианты:

  1. Плоскоклеточная метаплазия: наличие метаплазированных клеток в препарате в небольшом количестве свидетельствует о том, что эпителий из зоны трансформации попал в препарат. Большое количество метаплазированного эпителия в материале может быть при заживающем эктропионе.
  2. Паракератоз, гиперкератоз: процессы ороговения в верхних слоях эпителия могут быть вызваны защитной реакцией клеток и проявляться при хронических воспалительных процессах, воздействии гормональными препаратами, реакцией на ВПЧ-инфекцию, нарушением трофики тканей. Покраска по Папаниколау позволяет цитологу четко дифференцировать клетки с пара- и гиперкератозом. Паракератоз часто встречается при вирусных инфекциях, в частности при ВПЧ-инфекции. По нашим наблюдениям, наличие клеток с паракератозом у женщин без интраэпителиальных поражений сочетается с невысокими титрами ВПЧ высокого онкогенного риска. При увеличении титра, в препаратах кроме паракератоза появляются диспластические изменения в клетках.
  3. Трубная метаплазия: состояние, в результате которого эндоцервикальный эпителий шейки матки замещается на эпителий, имеющий строение, сходное с эпителием маточной трубы. Трубная метаплазия встречается после хирургического вмешательства на шейке матки.
  4. Атрофия: при снижении уровня эстрогенов клетки плоского эпителия не созревают до поверхностных слоев и в препарате, в зависимости от степени атрофии, превалируют клетки парабазальные и промежуточные. Иногда при атрофии цитологически сложно дифференцировать наличие интраэпителиальных поражений, т. к. парабазальный эпителий может довольно «атипически» реагировать на воспалительный процесс (а степень дисплазии зависит от наличия парабазальных клеток в препарате и их атипии). Если невозможно исключить неопластические изменения, женщине следует назначить местное лечение эстрогенами и затем взять мазок повторно или использовать иммуноцитохимические маркеры для определения доброкачественности процесса.
  5. Изменения, связанные с беременностью: изменения во время беременности могут быть неверно истолкованы как предопухолевые или опухолевые, в первую очередь потому, что отмечаются изменения в ядрах, что связано с гормональными изменениями. Могут встречаться клетки плоского эпителия с укрупненными ядрами и измененной структурой хроматина, в цилиндрическом (эндоцервикальном) эпителии можно наблюдать реакцию Ариас-Стеллы – большие единичные клетки и синцитиальные пласты с мелко вакуолизированной цитоплазмой. При наличии таких клеток в препарате (без знания анамнеза пациентки) ошибочно может быть диагностирован железистый рак.

Реактивные изменения:

  1. Воспалительные, включая репаративные: эпителиальные клетки не принимают активного участия в воспалительной реакции, но реагируют на нее путем дегенеративных и регенеративных изменений, т. е. гибелью клеток, репаративным процессом и ростом. Эпителизация дефектов слизистой оболочки, вызванных воспалением (репарация), происходит за счет выраженной пролиферации клеток. Клетки при этом увеличиваются в размерах, появляются гипертрофированные ядрышки (особенно такие изменения выражены при гонорейной, хламидийной, герпетической, трихомонадной инфекциях). При активном репаративном процессе клетки могут приобретать признаки атипии и цитологически не всегда отличимы от неопластических изменений. Поэтому при репаративных процессах может быть выставлен диагноз ASC-US, который предполагает наблюдение в динамике и дообследование.
  2. Лимфоцитарный цервицит характеризуется лимфоидной инфильтрацией шейки матки. Эти доброкачественные изменения чаще встречаются в постменопаузе и не сопровождаются симптомами заболеваний. Дифференциальный диагноз проводится с лимфосаркомой.
  3. Лучевые изменения: появляются уже через несколько дней после начала терапии, характеризуются наличием большого количества лейкоцитов и эритроцитов с некротическими массами, позже фаза деструкции сменяется лимфоидной реакцией. Большая часть постлучевых изменений исчезает через 6 месяцев, однако у части пациенток наличие измененных диспластических клеток можно наблюдать на протяжении всей жизни. Прогностическое значение постлучевой дисплазии достоверно не изучено.
  4. Изменения, связанные с внутриматочной контрацепцией: наличие ВМС как инородного тела приводит к определенным изменениям – реактивным изменениям в клетках железистого эпителия, наличию элементов хронического воспаления.

Возбудители:  Trichomonas vaginalis, кокко-бацилярной флоры, грибов, морфологически сходных с родом Candida spp., бактерий, морфологически сходных с Actinomyces, клеточных изменений, связанных с вирусом Herpex simplex., Cytomegalovirus.

Таким образом, достаточно большой процент традиционных возбудителей воспалительного процесса не входит в данный перечень, что приводит к необходимости (при получении результатов цитологического исследования с воспалительным характером изменений и отсутствием вышеперечисленных микроорганизмов) проводить дополнительное обследование женщины, в первую очередь, методами молекулярной диагностики.

Что включено в категорию «Другие» и что это дает практическому врачу?

В категорию «Другие» относится указание о выявлении эндометриальных клеток у женщин старше 45 лет.

Отслоившиеся клетки эндометрия являются нормой при обследовании женщин во время менструации и пролиферативной фазы менструального цикла. Обнаружение их в период постменопаузы может рассматриваться как один из признаков неоплазии эндометрия. В 1988 г. вводится указание данных клеток у женщин в постменопаузе для информирования  врачей о возможном наличии патологии эндометрия. В 2001 г. рекомендовано отмечать наличие эндометриальных клеток у женщин уже старше 40 лет, учитывая, что зачастую данных о менопаузальном статусе нет. Это привело к увеличению количества исследований состояния эндометрия, что в большинстве случаев было необоснованным. Поэтому в системе Бетесда 2014 г. возраст указания наличия данных клеток увеличен до 45 лет для снижения количества необоснованных процедур.

START TYPING AND PRESS ENTER TO SEARCH